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响应面法优化纤维素降解菌的发酵产酶条件
摘要 本文对筛选得到的高效纤维素降解菌——H-3菌株的发酵产酶条件进行了优化。利用单因素试验、Plackett–Burman 实验设计和响应曲面设计对菌株产纤维素酶的发酵条件进行了优化。实验主要以羧甲基纤维素酶活（CMCase）为指标，评价了碳源、氮源、无机盐、起始pH 值、接种量和装液量6个因素对菌株产酶能力的影响，得出酵母粉、装液量和起始pH为主要显著性影响因素，通过Design-Expert软件分析出菌株产酶最佳发酵条件是酵母粉含量为20.92g/L、装液量52.51mL、起始pH为 6.69；发酵培养的其他条件分别为葡萄糖含量为14g/L、胰蛋白胨含量为22g/L、KH2PO4含量为6g/L、接种量10%，此时，酶活力为1721.08U/mL，较优化前产酶酶活力提高了72.20%。
关键词 响应面法;Plackett–Burman ;发酵条件优化
Optimization of Fermentation Enzyme Conditions of Cellulose Degradation Bacteria by Response Surface Method
Wang Chunqing Tang Leli Zhang Mengle Chen Weicong Wang Zhuoya Li He *
Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Basic Sciences, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou,510006
* Corresponding author, lihe32@163.com
Abstract In this study ,For the efficient cellulose degradation strains of H-3, its fermentation conditions were optimized to produce more enzymes. Single-factor experiments, Plackett-Burman design and response surface design were used to optimize the cellulase-producing fermentation conditions. The experiments using carboxymethyl cellulase (CMCase) as the index, evaluated the 6 factors of carbon source, nitrogen source, inorganic salts, initial pH, inoculation amount and liquid volume on the influence of the strain’s ability of enzyme production. The results showed yeast powder, liquid volume and initial pH is the main influence factors. Through the analysis of Design-Expert software, the optimum fermentation conditions of enzyme production is as follows: 20.92 g/L of yeast strains, 52.51 mL of liquid volume and initial pH 6.69; and other conditions of the fermentation were 14g/L of glucose, 22g/L of peptone, 6g/L of KH2PO4, 10% of inoculation amount. In this conditions, the enzyme activity was 1721.08U/mL. Compared with the original culture conditions, the enzyme activity have increased by 72.20%.
Keywords response surface method;Plackett–Burman;optimization of fermentation condition
纤维素是植物进行光合作用的主要产物，是自然界含量最多的、分布最广的可再生有机资源，每年有1.5×1012t以上的植物性有机物质在地球上产生，其中一半以上含有的是纤维素与半纤维素[1]。全世界由于社会经济的发展，人口的增加，资源短缺、能源匮乏、环境恶化等问题日趋恶化。纤维素作为地球上最简单易得、随处可见的物质，是继煤油、石油、天然气之后可再生的第四大能源——生物质的主要成分[2]，对其的开发利用早就已经开始[3]。我国自古以来就是以农为本，纤维素资源极为丰盛，每年可产生12×109t[4]。然而这些纤维素资源随着煤气和液化气的推广，除了少部分用来堆肥外，大部分被直接丢弃或就地焚烧，并未得到有效利用，且对环境造成了污染[5-7]。对纤维素进行开发利用，是探索新能源的必然需求，对其进行研究和应用符合人类可持续发展策略，对于解决目前全人类共同面临的资源耗竭危机具有十分重要的意义[8]
大自然中，纤维素的降解需要分解者——微生物来完成，这是因为微生物可以产生降解纤维素的酶类物质，从而对其进行分解。传统的纤维素处理包括物理和化学方法，物理方法只能对含纤维素的有机物质进行外部的粉碎等，并不能对其内部的结构进行破坏，而化学方法（酸碱等化学试剂处理）对仪器设备要求高，生产成本高，对环境污染大，因此，寻找一种高效产纤维素酶的菌株，对含纤维素的有机物质进行资源化利用使其降解为可利用的葡萄糖，在此基础上可用葡萄糖生物发酵生产乙醇、生物燃料等，可极大地改善我国的能源危机、资源短缺、环境恶化等问题[9]。当前首要任务是筛选高效纤维素降解菌，优化其产酶条件，从源头提高纤维素酶活力，为纤维素酶的应用争取更广阔的空间 [10]。
1 材料与方法
1.1 实验菌株
实验前期从黑龙江玉米地土壤筛选得到的产纤维素酶的H-3菌株，E. coli BL2l（DE3）为本实验室保存。
1.2 实验主要设备和试剂
电子天平、高压灭菌锅、鼓风干燥箱，舜宇恒凭仪器公司；恒温培养箱、无菌操作台，德国HERAS公司；恒温震荡仪，上海南荣实验设备公司；台式离心机，Eppendorf公司；酶标仪，美国Bio-Rad公司；pH计，雷磁PHS-2F，上海仪电仪器公司。葡萄糖标准品，上海诗丹德公司；葡萄糖，华大公司；胰蛋白胨、酵母提取粉、琼脂粉，Coolaber公司；羧甲基纤维素钠（CMC-Na），福晨试剂厂；氯化钠、磷酸二氢钾，广州化学试剂厂；其他试剂均来自国产分析纯。
1.3 实验方法
单因素法优化纤维素降解菌的产酶条件
本实验采用碳源、氮源、无机盐、起始pH 值、接种量和装液量6个因素对纤维素降解菌发酵产纤维素酶能力的影响进行了单因素分析筛选。
在CMC-Na固体培养基接种划线的H-3菌株，挑选单菌落至25ml CMC-Na液体种子培养基中，28℃、180rpm恒温摇床培养15h至培养液浑浊。以2%的接种量接种至含25ml液体培养基（250ml锥形瓶）中，于28℃，180rpm摇床培养5d，在4℃、8000r/min条件下离心10min，上清液即为粗酶液，测量粗酶液的CMCase与FPase，平行3次实验。
1.1.1 最佳碳源与最佳碳源浓度的选择
在初始发酵培养基中CMC-Na为主要的碳源，所以在其它条件不变的情况下以10g/L的8种糖作为碳源，测定不同碳源对菌株产酶能力的影响。以最佳碳源时菌株产酶能力为100%，绘制不同碳源对菌株发酵产酶能力的相对酶活柱状图。
最佳碳源为发酵培养基碳源成分，研究其浓度0~24 g/L对菌株发酵产酶能力的影响，以最佳碳源浓度时菌株发酵产酶能力为100%，绘制碳源浓度对菌株发酵产酶能力的相对酶活曲线。
1.1.2 氮源及复合氮源配比的选择
在初始发酵培养基中有蛋白胨与酵母粉两种氮源，所以研究以20g/L的蛋白胨、酵母粉、硫酸铵以及尿素4种单一成分的氮源替换，测定不同氮源对菌株发酵产酶能力的影响。以最佳氮源时菌株发酵产酶能力为100%，绘制不同氮源对菌株发酵产酶能力的相对酶活柱状图。
实验发现在初始培养基中以胰蛋白胨与酵母粉两种氮源存在下，菌株产酶能力最佳，所以选择酵母粉和胰蛋白胨为复合氮源，探索它们之间的最佳浓度配比。以最佳氮源配比时菌株发酵产酶能力为100%，绘制复合氮源配比对菌株发酵产酶能力的相对酶活曲线。
1.1.3 无机盐及其浓度的影响
在初始发酵培养基中KH2PO4为作为无机盐，其他条件不变，现用 6种无机盐进行替换，固定浓度为1g/L，考察不同无机盐对菌株发酵产酶能力的影响。以选择最佳无机盐种类时菌株发酵产酶能力为100%，绘制不同无机盐对菌株发酵产酶能力的相对酶活柱状图。
选择最佳无机盐种类，研究其浓度0~24 g/L对菌株发酵产酶能力的影响，以最佳无机盐浓度时菌株发酵产酶能力为100%，绘制最佳无机盐的浓度对菌株发酵产酶能力的相对酶活曲线。
1.1.4 起始pH的选择
改变发酵培养基的起始pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），测量培养基不同起始pH值对菌株发酵产酶能力的影响。以最适pH时菌株发酵产酶能力为100%，绘制pH对菌株发酵产酶能力的相对酶活曲线。
1.1.5 接种量的选择
设置不同接种量（2%、6%、10%、14%、18%、22%），考察不同接种量对菌株发酵产酶能力的影响。以最佳接种量时菌株发酵产酶能力为100%，绘制不同接种量对菌株发酵产酶能力的相对酶活曲线。
1.1.6 装液量的选择
设置不同装液量（20、30、40、50、60、70），考察不同装液量对菌株发酵产酶能力的影响。以最佳装液量时菌株发酵产酶能力为100%，绘制不同装液量对菌株发酵产酶能力的相对酶活曲线。
1.4 Plackett-Burman 实验设计
对单因素实验中7个影响因素对菌株发酵产酶能力的影响进行分析统计，确定发酵培养基的组成成分及各成分浓度和各培养条件的合理范围，使得菌株产酶的最优条件在此区间内，并估取高水平（+1）和低水平（-1），然后进行实验设计（表1）。
采用Design-Expert软件进行PB实验设计，一共有12组PB试验，每组试验进行3个平行实验。以羧甲基纤维素酶活力（CMCase）为指标，测量各组试验条件的产酶量，平行3次实验（表2）。
1.5 Box-Behnken实验设计
Box-Behnken 设计是对 PB 实验筛选的关键培养基组分进行进一步的优化 （表4），(表5)
2 结果与分析
2.1 单因素法优化纤维素降解菌的产酶条件
2.1.1 最佳碳源与碳源浓度的选择
选择最佳碳源，结果显示葡萄糖做碳源时菌株发酵产酶能力最高，其次是麦芽糖、甘油、淀粉与果糖，以滤纸和无水碳酸钠做碳源产酶能力较弱（图1）；选择葡萄糖为最佳碳源，分析不同浓度葡萄糖（0g/L-24g/L）对菌株产酶影响，结果发现发发酵培养基中低浓度的葡萄糖反而使发酵菌株产酶量减少，不过随着加大葡萄糖的浓度，产酶量迅速增加，在葡萄糖浓度为16 g/L时，产酶量最高，之后下降（图2），说明葡萄糖浓度过低过高都会影响发酵菌株的代谢。
图1 不同碳源对菌株发酵产酶能力的影响
图2 葡萄糖浓度的选择
2.1.2 最佳氮源及复合氮源配比的选择
实验结果显示（图3）两种有机氮源对菌株发酵产酶效果良好，差别不大，而无机氮源的产酶量显著低于有机氮源，有机氮源中混合有机氮源比单一氮源产酶效果更好，故选择混合氮源为最佳氮源。
以酵母粉和胰蛋白胨作为复合氮源，改变两种氮源之间的配比，结果显示当酵母粉和蛋白胨的比例为1:1时，菌株发酵产酶量最高（图4）。
图3 不同氮源对菌株发酵产酶能力的影响
图4 最佳复合氮源配比的选择
2.1.3 无机盐及其浓度的影响
无机盐是微生物生长过程中不可缺少的物质，作为酶的组成部分，酶的抑制剂或激活剂，参与调节培养基的渗透压平衡。如图5，不同无机盐对菌株发酵产酶有不同的影响，其中KH2PO4、K2HPO4、CaCl2、MgSO4和FeSO4 5种无机盐对菌株产酶效果较好，而含CuSO4与ZnSO4的发酵培养基产酶效果较差。综合考虑到产酶量和成本问题，选择KH2PO4作为最佳无机盐。探索不同浓度KH2PO4对菌株产酶影响，发现菌株在KH2PO4浓度分别为12g/L、8g/L时，其羧甲基纤维素钠酶活力和滤纸酶活力最大，所以选择6 g/L-14 g/L范围为最适合浓度（图6）。
图5 不同无机盐对菌株发酵产酶能力的影响
图6 KH2PO4浓度的选择
2.1.4 最佳起始pH
在发酵培养基起始pH为3-9之间时，随着pH值的增加，菌株产酶量先升后降，在pH为5时，菌株产酶量最高，故选择pH 5为最适起始pH（图7）。
图7 起始pH的选择
2.1.5 最佳接种量
由图8可知，在接种量14%左右时，菌株发酵产酶量达最大值，但随着接种量继续的增加，可能会引起菌种间生长竞争抑制，产酶量减少。
图8 接种量的选择
2.1.6 最佳装液量
由图9可知，在250mL的锥形瓶中，装液量到50mL时，菌株发酵产酶量达最大值；装液量60mL时，产酶量呈现下降趋势，可能是由于装液量的增加影响瓶中氧气和在摇床上搅拌的效果，导致产酶量减少；在装液量70mL时，产酶量又呈现上升趋势，可能是由于发酵液营养丰富，增加了产酶量，考虑到发酵成本问题，选择50mL为最佳装液量。
图9 装液量的选择
2.2 Plackett-Burman 实验结果
PB实验可以筛选出影响菌株发酵产酶量的主要因素，本实验各变量的水平设置见表1，其试验设计及结果结果见表2，各因素的方差分析见表3。
表1 Plackett-Burmen试验因素水平表
|
编号 |
因素 |
单位 |
低水平 |
高水平 |
|
A |
葡萄糖 |
g/L |
12 |
20 |
|
B |
酵母粉 |
g/L |
16 |
32 |
|
C |
胰蛋白胨 |
g/L |
8 |
24 |
|
D |
磷酸二氢钾 |
g/L |
4 |
12 |
|
E |
接种量 |
% |
6 |
14 |
|
F |
装液量 |
mL |
40 |
60 |
|
G |
起始pH |
|
5 |
7 |
|
H |
空白 |
- |
-1 |
1 |
|
J |
空白 |
- |
-1 |
1 |
|
K |
空白 |
- |
-1 |
1 |
|
L |
空白 |
- |
-1 |
1 |
表2 Plackett-Burmen设计表及试验结果
