复方青蒿琥酯阿莫地喹片含量及溶出度国际药典标准的建立

孙海玲 孙春艳

（湖北省药品监督检验研究院 武汉 430075）

摘要 目的 制定复方青蒿琥酯阿莫地喹片的含量及溶出度国际药典标准的测定方法 方法 采用高效液相方法， 色谱柱：Hypersil BDS C₁₈（10 cm x 4.6 mm3 µm），检测波长：201nm（青蒿琥酯），300nm（盐酸阿莫地喹）；流动相：流动相A为 0.01mol•L^-1 : 0.1mol•L^-1 辛烷磺钠＝47：53（用磷酸调节pH＝3.0），流动相B为乙腈；采用梯度洗脱。检测温度为30℃；结果：青蒿琥酯及阿莫地喹的线性范围为0.2～1mg•ml^-1（r=0.9999）与0.5～2.5m•/ml^-1(r=0.9999).平均加样回收率分别为99.13％（RSD%=0.84%）及99.79％（RSD%=0.4%）。结论：本文建立的含量测定及溶出度测定方法，具有操作简便、结果准确、结果准确、重现性良好的特点，可用于复方青蒿琥酯阿莫地喹片的质量控制。

关键词：青蒿琥酯 阿莫地喹 抗疟 国际药典

Establishment of international pharmacopoeia standard for the content and dissolution of Artesunate and Amodiaquine Tablets

Sun Hai-ling  Sun Chun-yan  

（Hubei  Institute for Drugcontrol，Wuhan 430075， China）

ABSTRACT Objective To estaplish a HPLC method for the determination of contents and the dissolution of the  Artesunate and amodiaquine in Artesunate and amodiaquine tablets. Methods  A stainless steel column (10cm x 4.6mm) packed with base-deactivated particles of silica gel, the surface of which has been modified with octadecysilyl groups (3 µm) was used .The mobile phase:mobile phase A:Dissolve 21.63 g of sodium octanesulfonate R and 1.36 g of potassium dihydrogen phosphate Rin about 900 ml of water R. Adjust the pH to 3.0 by adding phosphoric acid (~1440 g•/l^-1)and dilute to 1000 ml. mobile phase B: acetonitrile, the flow rate was 1.0ml

•min^-1. As detector use an ultraviolet spectrophotometer set at a wavelength of 300 nm for amodiaquine (retention time = about 9.219min) and, for artesunate(11.253min), at 210 nm. Maintain the column temperature at 30 ℃. Results the standard curve was linear in the range of 0.2～1mg•ml^-1（r=0.9999）(Artesunate) and 0.5～2.5mg•ml^-1(r=0.9999) (amodiaquine) , average recoveries were 99.13％（RSD%=0.84%）(Artesunate) and 99.79％（RSD%=0.4%） (amodiaquine). Conclusion the method is accurate and sensitive, and it can be used to control the quality of  Artesunate and amodiaquine tablets.

Key words: HPLC;  Dissolution;  Artesunate and amodiaquine tablets

疟疾是热带、亚热带最为常见的疾病之一^[12]。在许多第三世界国家，疟疾的发病率和死亡率仍居高不下。盐酸阿莫地喹青蒿琥酯联合用药，是世界卫生组织（WHO）推荐的优质抗疟药。青蒿琥酯主要作用于疟原虫红内期无线体，作用方式主要是干扰表膜线粒体的功能，对传统药物产生抗药性的恶性疟疾有着很高的活性，缺点是该产品半衰期短，杀虫不彻底。阿莫地喹能有效的杀灭红内期内各种无性体，其缺点是其毒性比其他的抗疟药大。因此阿莫地喹与青蒿琥酯联合用药治疗疟疾十分有效。目前有赛诺菲等国外公司的复方青蒿琥酯阿莫地喹片上市，国内仅有桂林南药股份有限公司生产该复方制剂。而我国为青蒿琥酯原料的主要来源。国际药典是由世界卫生组织（WHO）编纂出版，供WHO成员国免费使用。许多国家，尤其是非洲各成员国将《国际药典》作为本国或地区的认可标准，即具有法律效应。通过WHO药品专家委员会的不懈努力和严格审定，国际药典在联合国采购基本药物中的抗疟、抗结核、抗艾滋等急需和需WHO优先采购的药品时发挥着越来越大的积极作用。现行复方青蒿琥酯阿莫地喹片无统一的国际标准，我院受中国食品药品检定研究院检院委托，起草复方青蒿琥酯阿莫地喹片国际药典标准。通过查阅资料及与国内外生产该复方制剂的厂家合作，建立了高效液相（HPLC）法同时测定两个主要成分的含量及溶出度，该法便捷、准确，能有效的控制该复方制剂的质量。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 waters 型高效液相色谱仪（美国waters公司，配四元梯度泵，DAD检测器）；梅特勒型电子分析天平；RCZ-8M型智能溶出实验仪（天津市天大天发科技有限公司）。

 复方青蒿琥酯阿莫地喹片样品为赛诺菲公司（批号为P02813、4MA056、4MA049、4MA225）和桂林南药股份有限公司（批号为SH150101、SH141105、SH141209）提供。青蒿琥酯原、阿莫地喹原料由桂林南药股份有限公司提供。青蒿琥酯对照品（Lot No: WS/ART/043,99.8%）及青蒿琥酯杂质对照品（青蒿素：Lot No: 100202-200402,99.0%,NICPBP；脱水青蒿素：Lot No: PD DHA 01/08,98.5%；）、阿莫地喹对照品（Code:1031004,99.9%,USP）及阿莫地喹杂质对照品（磷酸氯喹：Code:100421-200401 ,98.9%,NICPBP,dried at 120℃ for 6h before use）由中国食品药品监督检验研究院体提供。乙腈（色谱纯）；辛烷磺酸钠（分析纯）；磷酸二氢钾（分析纯）；乙酸钠（分析纯）；乙酸（分析纯）。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件  色谱柱 Hypersil BDS C₁₈（10 cm x 4.6 mm3 µm）；流动相A为 0.01mol•L^-1 : 0.1mol•L^-1 辛烷磺钠＝47：53（用磷酸调节pH＝3.0），流动相B为乙腈；检测温度为30℃；流速为1.0ml•min_-1;进样量为20μl；采用双波长210nm（青蒿琥酯）及300nm（阿莫地喹）为检测波长。按下列梯度进行检测。

2.1.2 供试品溶液  取本品20片，精密称定，研磨，混匀，精密称取适量（相当于青蒿琥酯50mg，阿莫地喹135mg）置于100ml量瓶中，加入85ml稀释溶剂（pH＝3.8的磷酸缓冲液：乙腈＝47：53），超声10min，放置室温，稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液进样。

2.1.3 对照品溶液  精密称取青蒿琥酯对照品25mg及88mg盐酸阿莫地喹对照品置50ml量瓶中，加入40ml稀释溶剂超声10分钟，放冷，用稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.1.4 系统适用性溶液 精密称取2mg青蒿素对照品及2.7mg的氯喹对照品置于20ml量瓶中，加入18ml的对照品溶液，超声使溶解，用对照品溶液稀释至刻度。

2.1.5 专属性实验 取系统适用性溶液进样，按“2.1.1”项下的色谱条件测定，结果见图1～2。由图1可见青蒿琥酯在210nm条件下，青蒿琥酯（保留时间11.864min）与盐酸阿莫地喹（保留时间9.219min）及青蒿素（保留时间为15.896min）分离良好。图2可见阿莫地喹在300nm波长下，阿莫地喹与氯喹分离良好，青蒿琥酯在此波长下不出峰。说明专属性较强，辅料及杂质对青蒿琥酯及阿莫地喹含量测定无干扰，方法专属性较强。

图1 青蒿琥酯含量系统适用性（210nm）

图2 阿莫地喹含量系统适用性（300nm）

2.1.6 标准曲线的制备 精密称取200mg青蒿琥酯与500mg盐酸阿莫地喹置于100ml量瓶中，用稀释溶剂溶解并稀释至刻度，精密量取10.0ml、5.0ml、3.0ml、2.0ml，分别置于不同的20ml量瓶中，用稀释溶剂稀释至刻度，摇匀进样。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，得到青蒿琥酯与阿莫地喹的回归方程分别为：Y=144294.9X-68454.9（ r＝0.9999）；Y=4000000X+779069 （r＝0.9999）。结果表明，青蒿琥酯与阿莫地喹分别在0.2～1mg•m^l-1与0.5～2.5mg•ml^-1范围内线性关系良好。

2.1.7 精密度实验 取同一供试品溶液，连续进样6次，记录青蒿琥酯与阿莫地喹的峰面积，青蒿琥酯的RSD为1.1％，阿莫地喹的RSD为1.4％。表明仪器精密度良好。

2.1.8 稳定性实验  取同一供试品溶液，在0、1、2、4、6、8、12h进样，测定青蒿琥酯与阿莫地喹的峰面积，青蒿琥酯的的RSD为0.57％，阿莫地喹的RSD为0.47％。表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

2.1.9 加样回收率 分别精密称取已知含量（批号：SH150101 称样量：0.3478g）的80％、100％、120％的粉末适量各3份，分别置于100ml量瓶中，分别加入含青蒿琥酯2mg•ml^-1与阿莫地喹5mg•m^-1l的溶液5ml，以稀释溶剂定容，摇匀进样，计算回收率。结果青蒿琥酯平均回收率为99.13％，RSD＝0.84％；阿莫地喹平均回收率为99.79％，RSD＝0.4％。见表1。

表1 青蒿琥酯与阿莫地喹加样回收实验结果

2.2 溶出度测定

2.2.1 取本品6片（批号SH150101，规格青蒿琥酯/阿莫地喹 100mg/270mg），按照《中华人民共和国药典》2015版第四部溶出度测定第二法，以pH＝5.5的醋酸缓冲盐（取醋酸钠80g至500ml水中使溶解，加入5.9ml冰乙酸，用水稀释至1000ml）900ml（规格青蒿琥酯/阿莫地喹 100mg/270mg）、500ml（规格青蒿琥酯/阿莫地喹 50mg/135mg和25mg/135mg）为溶出介质，转速为100转每分钟，溶剂温度37＋0.5℃.依法操作，经15、20、25、30、35分钟时，取溶液适量，滤过，精密吸取续滤液，经0.45μm的滤膜滤过，滤液作为供试品溶液^[4-5]。另精密称取青蒿琥酯10.0mg和盐酸阿莫地喹35.0mg置200mL量瓶中，加入80mL甲醇使溶解，用溶出介质稀释至刻度作为对照溶液。供试品溶液与对照品溶液按“2.1.1”项下色谱条件测定.计算出每片在各时间点的累计溶出量及6片的平均溶出量。见表2～3及图3～5。

图3 青蒿琥酯累积溶出曲线

图4 盐酸阿莫地喹累积溶出曲线

在溶出过程中，由于溶出介质为弱酸性的（PH＝5.5），青蒿琥酯在酸性条件下迅速的水解为青蒿素，由于青蒿琥酯在体内水解为青蒿素产生药效，故我们考察了在整个溶出过程中青蒿素的量。从表4可以看出，青蒿素的量并没有随溶出时间增多，而且累积溶出量均低于1％，故在我们计算溶出度的时候，选择忽略青蒿素的溶出量。

图5 青蒿素累积溶出曲线

 3.讨论

3.1 目前，复方青蒿琥酯阿莫地喹片为国际用药，但是在国际药典上没有统一的标准，均采用厂家单一标准，用药安全存在一定的隐患。应国际药典委员会的要求，在参考了三个生产厂家的标准及查询相关文献，拟定了本文的高效液相方法测定复方青蒿琥酯阿莫地喹片的含量及溶出度。

3.2 复方青蒿琥酯阿莫地喹片为复方制剂^[6]，由于主要成分青蒿琥酯与盐酸阿莫地喹在生产过程中会发生化学反应，故该复方制剂为双层片。在考察含量测定的过程中，我们分别考察对比了文献及各药典的单方标准^[7~13]，本文2.1高效液相法在同一条件下可以同时测定两个含量，操作简便快捷，专属性好，结果准确可靠.                                                                   

3.3 本文采用同一个液相条件同时检测复方制剂的两个有效成分，简单、快捷、有效，经方法学验证，两个成分在检测过程中不相互影响；在溶出度考察中，同样采取同一方法考察了溶出行为并采用含量方法进行检测，方法学验证中两个成分不产生影响，能够快捷有效的考察复方制剂的体外溶出行为。专属性好，不受辅料影响。 为控制复方青蒿琥酯阿莫地喹片的质量提供了技术支持，为同类型的复方制剂的方法建立提供了新的思路。

3.3 波长的选择 由于该品种有两个成分，为了考察两个成分的在两个波长处210nm（青蒿琥酯）及300nm（阿莫地喹）是否相互影响，在200～400nm波长范围内进行了紫外进行扫描，并在实验过程中采用了DAD检测。

图6 样品的紫外扫描图

参考文献

[1] HPLC法测定复方青蒿琥酯阿莫地喹片中青蒿琥酯的含量[J]. 中国生化药物杂质. 2015.3.35

[2] RP-HPLC法测定复方青蒿琥酯阿莫地喹片中主药的含量[J].淮海工学院学报. 2014.2.23.

 [3] 青蒿琥酯片溶出度方法学验证.中国现代医生.2014.54.26

[4] 盐酸阿莫地喹片溶出度测定的方法学研究. 海峡药学.2014.26.7

[5]青蒿琥酯与阿莫地喹双层片及其制备方法.专利号：200510026511.1

[6] USP 36Artesunate tablets and Amodiaquine tabletsMonograph

[7] Intern ational Pharmacopoeia 2015,Artesunate tablets

[8]BP 2015Artesunate tablets , Amodiaquine tablets Monograph

[9]EP 8.0Artesunate,AmodiaquineMonograph

[10] Indian Pharmacopoeia 2010Artesunate tablets, Amodiaquine tablets Monograph

[11] 中国药典2015版二部。注射用青蒿琥酯. 盐酸阿莫地喹片。

[12] WHO Model List of Essential Medicines, 21th List, March 2017。